La aplicación de la técnica de edición del genoma basada en CRISPR/Cas9 al levadura ha hecho posible modificar simultáneamente varios sitios, en particular para integrar varios cassettes de expresión. Los métodos existentes proporcionan una alta eficiencia para tales modificaciones; sin embargo, los protocolos comunes incluyen varios pasos preparatorios, a saber, la construcción de una cepa intermedia que expresa Cas9, el ensamblaje de un plásmido que lleva varios cassettes de expresión de ARN guía único (sgRNA) y los fragmentos de ADN integrados circundantes con largos flancos para la recombinación con los loci objetivo. Dado que estos pasos preparatorios son consumidores de tiempo y pueden no ser deseables en algunos tipos de experimentos, exploramos la posibilidad de una integración múltiple sin estos pasos. Hemos demostrado que es posible omitirlos simultáneamente e integrar hasta tres cassettes de expresión en sitios separados al transformar la cepa receptora con el plásmido de expresión de Cas9, tres plásmidos de sgRNA marcados de manera diferente y tres ADN donantes flanqueados con brazos cortos (70 pb) para la recombinación. Este hallazgo aumenta la flexibilidad al elegir el diseño experimental óptimo para la edición múltiple del genoma y puede acelerar significativamente tales experimentos.