El estrés por sequía es un estrés abiótico importante que obstaculiza el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los brasinosteroides (BR), incluyendo el 2,4-epibrassinolida (EBR), desempeñan roles importantes en el crecimiento y desarrollo de las plantas, así como en las respuestas a los estreses abióticos, incluyendo el estrés por sequía. Este trabajo investiga los roles de la aplicación exógena de EBR en la mejora de la tolerancia a la sequía en el tabaco. Las plantas de tabaco se dividieron en tres grupos: WW (bien regadas), DS (estrés por sequía) y DSB (estrés por sequía + 0.05 mM EBR). Los resultados revelaron que el DS disminuyó el grosor de la hoja (LT), mientras que la aplicación de EBR reguló al alza los genes relacionados con la expansión celular, que fueron inducidos por la vía de señalización de BR y IAA. Esto promovió el LT en un 28%, aumentando la adaptación de la planta. Además, la aplicación de EBR mejoró las actividades enzimáticas de SOD (22%), POD (11%) y CAT (5%) y la expresión de sus genes relacionados, junto con una mayor acumulación de sustancias osmorreguladoras como la prolina (29%) y azúcares solubles (14%) bajo DS y confirió tolerancia a la sequía. Finalmente, la aplicación de EBR aumentó los contenidos de auxina (IAA) (21%) y brasinolida (131%) y reguló al alza los genes relacionados con la tolerancia a la sequía inducidos por las vías de señalización de BR y IAA. Estos resultados sugieren que podría desempeñar un papel importante en la mejora de los mecanismos de tolerancia a la sequía en el tabaco.