El algodón es uno de los cultivos más importantes económicamente en el mundo, y la sequía es un factor abiótico clave que puede reducir significativamente el rendimiento del algodón. Los factores de transcripción MADS-box desempeñan roles esenciales en varios aspectos del crecimiento y desarrollo de las plantas, así como en las respuestas al estrés biótico y abiótico. Sin embargo, el uso de factores de transcripción MADS-box para regular las respuestas al estrés hídrico no se ha explorado completamente en el algodón. Aquí, mostramos que GhAGL16 actúa como un regulador negativo del déficit hídrico en el algodón, al menos en parte regulando la señalización de ABA. Las plantas transgénicas sobreexpresoras (-OE) tenían tasas de supervivencia y contenidos de agua relativa (RWCs) más bajos bajo estrés hídrico. Las hojas aisladas de -OE mostraron tasas de pérdida de agua aumentadas, probablemente atribuibles a su mayor densidad estomática. -OE también mostró longitudes de raíz primaria reducidas en respuesta al tratamiento con manitol y una disminución de la sensibilidad de la germinación de semillas al tratamiento con ABA. Por el contrario, el silenciamiento en el algodón mejoró la tolerancia al déficit hídrico al aumentar el contenido de prolina (Pro), aumentar las actividades de superóxido dismutasa (SOD) y peroxidasa (POD), y reducir los contenidos de malondialdehído (MDA) y peróxido de hidrógeno (HO) bajo estrés hídrico. Ensayos de localización subcelular y activación transcripcional confirmaron que GhAGL16 es una proteína nuclear que carece de actividad de autoactivación transcripcional. La expresión de genes relacionados con la biosíntesis de ABA, un gen relacionado con el catabolismo y un gen relacionado con la vía de señalización de ABA se alteró en plantas -silenciadas. En conjunto, nuestros datos demuestran que GhAGL16 desempeña un papel importante en la resistencia del algodón al estrés hídrico.